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如何提高显微镜的分辨率

2019/12/28

显微镜作为检测设备的主要设备之一,而评判显微镜性能的重要指标是分辨率。分辨率是指能清楚地分辨两个小点或两线间的较小距离。人眼本身就是一台显微镜,在标准照明条件下,人眼在明视距离(国际公认为25cm) 上的分辨率约等于1/ 10mm。对于观察两条直线来说,由于直线能刺激一系列神经细胞,眼睛的分辨率还能提高一些。


人眼的分辨率只有1/ 10mm, 那么比1/ 10mm 小的物体或比1/ 10mm 近的两个微小物体的距离,人眼就无法分辨了。所以出现了从简单的宏观放大镜到微观观测的光学显微镜,继而电子显微镜。显微镜的分辨率定义是指在标本上能清楚分辨的两个小点之间的较小距离。其计算公式为:


D=0.61λ/NA


式中:D 为分辨率(um);λ 为光源波长(um);NA 为物镜的数值口径(也称镜口率)。


由公式可得到,显微镜的分辨率决定于入射光源的波长以及所匹配物镜的数值孔径。由此可知,提高光学显微镜的方法:


1、降低光源波长。


可见光较短波长为390nm,若用此波长的紫外光作为照明光源,可使光学显微镜的分辨率降低至0.2um。但是由于大多数普通材料的玻璃会大量吸收340nm以下波长的光,紫外光经过大量衰减无法形成清晰、明亮的图像。因此不得不使用石英(可透过低达200nm的紫外光)、荧石(可透过低达185nm的紫外光)等价格昂贵的材料,并且紫外光显微镜不能用肉眼进行观察,甚至受观测样品的限制,再加上昂贵的造价,所以这种提高显微镜分辨率的方式由于其自身的局限性而不受广泛应用。


2、增加物镜的数值孔径NA.


数值孔径NA=n*sin(u)


式中,n为物镜与标本之间的介质折射率;u为物镜的二分之一孔径角。因此,从光学设计上适当采用较大的孔径角,或者增大折射率成为较常见的提高光学显微镜分辨率的方法。一般低倍物镜如10X以下其介质采用空气,折射率为1,即干燥系物镜;水浸介质是蒸馏水,其折射率为1.33;油浸物镜介质是香柏油或其它透明油,其折射率一般在1.52 左右,接近透镜和载玻片的折光率,如Olympus 的100X油镜。水浸物镜和油浸物镜不仅放大倍数高而且由于使用高折射率的介质,从而提高物镜的分辨率。

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